Persistenza a lungo termine della proteina spike SARS-CoV-2: prove e implicazioni

Abstract: Questo articolo discute il recente studio di Bansal et al. [1] sulla rilevazione della proteina spike in persone vaccinate con il vaccino Pfizer mRNA. La scoperta più significativa è che la proteina spike si trova sugli esosomi, cioè vescicole derivate dalle cellule, per almeno quattro mesi dopo la seconda iniezione. Questa persistenza sorprendentemente lunga aumenta la prospettiva di un'infiammazione prolungata all'interno e di danni agli organi che esprimono la proteina spike.

1. L'immagine finora: l'espressione della proteina Spike si verifica precocemente ed è di breve durata

Uno studio precedente sull'espressione della proteina spike dopo la vaccinazione con mRNA è stato riportato da Ogata et al. [2]. I pazienti in quello studio avevano ricevuto il vaccino Moderna, che è simile a quello prodotto da Pfizer. In particolare, entrambi i vaccini utilizzano mRNA che incorpora pseudouridina anziché uridina, il che influisce sulla stabilità in vivo delle molecole di RNA. Inoltre, mentre i due vaccini mostrano una certa deviazione di sequenza a livello di RNA, codificano la stessa sequenza di proteine ​​spike. Notiamo, tuttavia, che le nanoparticelle lipidiche utilizzate con i due vaccini differiscono nella composizione, il che potrebbe influenzare la distribuzione dei vaccini nel corpo e il decorso temporale dell'espressione della proteina spike.

1.1. Livelli plasmatici del frammento di proteina spike S1 e dell'intera proteina spike dopo la vaccinazione con mRNA

S1 è un frammento della proteina spike che viene scisso dalle proteasi già all'interno delle cellule che esprimono l'intera proteina e che può essere rilasciato nel flusso sanguigno una volta che la molecola proteica scissa appare sulla superficie cellulare. Il frammento S1 può legarsi ai recettori ACE2 sui trombociti e su altre cellule; ciò può contribuire alla patogenesi del COVID-19 [3] e anche agli effetti avversi della vaccinazione.

Secondo [2], i livelli plasmatici del frammento S1 aumentano rapidamente e diminuiscono nuovamente entro non più di due settimane. L'aumento ritardato dell'intera proteina spike è notevole, tuttavia l'espressione è ancora di durata molto più breve di quella apparente nello studio di Bansal (vedi sotto). Questo risultato, tuttavia, può derivare dall'interferenza degli anticorpi del paziente con questa misurazione (vedere la diapositiva successiva). Al contrario, il metodo analitico utilizzato da Bansal et al. [1] rimuove questa interferenza: rileverà la proteina spike anche se già legata agli anticorpi.

Si noti che Ogata et al. non hanno determinato se la proteina S1 o spike a lunghezza intera che hanno trovato nel plasma fosse presente in forma libera o legata a particelle di esosoma (vedi oltre). In teoria, S1 era libero, mentre la proteina spike a lunghezza intera potrebbe essere stata legata agli esosomi.

1.2. Livelli plasmatici di S1 ​​e anticorpi spike a lunghezza intera

Anche questi dati provengono dallo studio di Ogata. Gli anticorpi sia verso il frammento S1 che verso la proteina spike a lunghezza intera si sviluppano con un ritardo di 1-2 settimane dopo la prima iniezione; dopo la seconda dose, salgono di nuovo e più rapidamente. Il leggero calo dal giorno 0 al giorno 1 potrebbe essere dovuto alla rapida espressione della proteina spike, che legherebbe gli anticorpi preesistenti e li porterebbe fuori circolazione.

La risposta immunitaria abbastanza rapida dopo la prima iniezione suggerisce che è principalmente guidata dalla memoria immunologica, che sarebbe dovuta all'immunità crociata. Ciò concorda con uno studio di Nielsen et al. [4], che ha riscontrato una risposta altrettanto rapida all'infezione da SARS-CoV-2. Come ha sottolineato il Dr. Bhakdi, questa diffusa immunità incrociata significa che la maggior parte delle persone è protetta da malattie gravi dovute a SARS-CoV-2 anche senza vaccinazione [5].

Se confrontiamo questa figura con la precedente, vediamo che i livelli rilevabili del frammento S1 circolante e della proteina spike a lunghezza intera diminuiscono in concomitanza con l'aumento degli anticorpi. Ciò è previsto, alla luce del metodo di rilevamento utilizzato da Ogata et al. [2] (vedi le slide seguenti).

1.3. Saggio di Ogata: rilevamento di proteine ​​spike utilizzando anticorpi accoppiati a sfere magnetiche

Questa immagine illustra solo le fasi iniziali della procedura, vale a dire la cattura e la separazione della proteina spike dalla complessa miscela di proteine ​​presenti nel plasma sanguigno. Il metodo utilizza piccole sfere magnetiche rivestite con anticorpi contro la proteina spike. Questi vengono mescolati in un campione di plasma sanguigno e viene concesso un po' di tempo affinché la proteina spike o il frammento S1 si leghino alle perline. Successivamente, le perline possono essere recuperate utilizzando un magnete. Questa separazione è seguita da ulteriori passaggi che utilizzano ancora anticorpi e alla fine generano un segnale ottico; tuttavia, questi dettagli non devono interessarci qui.

1.4. Gli anticorpi indotti dal vaccino interferiscono con la cattura e il rilevamento delle proteine ​​spike

Una volta che la reazione immunitaria al vaccino si instaura e gli anticorpi della proteina spike appena formati compaiono nel flusso sanguigno, possono legarsi a S1 circolanti o alle molecole proteiche spike a tutta lunghezza e impedire la loro cattura da parte degli anticorpi accoppiati alle sfere magnetiche. Questo effetto può spiegare perché, nello studio di Ogata, i livelli di S1 ​​e della proteina spike a lunghezza intera rilevati nel plasma diminuiscono all'aumentare della quantità di anticorpi. Inoltre, i livelli più alti di spike a lunghezza intera arrivano solo dopo che è già presente una quantità consistente di anticorpi; questo probabilmente causerà la sottovalutazione anche di quei livelli più alti.

2. Sugli esosomi

Poiché lo studio di Bansal et al. [1] si occupa della proteina spike sugli esosomi, parleremo prima un po' degli esosomi in quanto tali.

2.1. Gli esosomi si formano pizzicando frammenti di membrana cellulare e citoplasma

Gli esosomi sono piccole vescicole di membrana, formate strappando frammenti di membrana cellulare da una superficie cellulare e riempite con fluido intracellulare e macromolecole. I due distinti percorsi illustrati qui - formazione intracellulare con successivo rilascio in massa, o formazione e rilascio direttamente sulla superficie cellulare - sono interessanti, ma non devono interessarci qui.

Gli esosomi trasportano molecole proteiche sulla superficie cellulare (i piccoli "club" neri nell'illustrazione) e anche macromolecole intracellulari (proteine ​​e RNA). Possono fondersi con, o essere assorbiti da, altre cellule e quindi trasmettere carichi e informazioni tra le cellule.

2.2. Funzioni fisiologiche soggette a regolazione da parte degli esosomi

• Coagulazione del sangue
• Attivazione o soppressione delle risposte immunitarie
• Infiammazione
• Crescita del tumore

Questo elenco non è esaustivo. Un'ottima recensione sull'argomento è [6], da cui è stata adattata l'illustrazione nella Sezione 2.1.

2.3. Particelle virali ed "esosomi" nell'infezione da epatite B

L'epatite B è una malattia virale trasmessa da emoderivati ​​infetti o per contatto intimo. In molti pazienti il ​​virus provoca un'infezione cronica che il sistema immunitario non riesce a debellare. Nel sangue di tali pazienti, si possono trovare non solo particelle di virus infettive, ma anche non infettive. Questi sono costituiti da membrane della cellula ospite, decorate con l'antigene di superficie virale, ma mancano degli acidi nucleici virali e delle proteine ​​del capside all'interno.

In questa immagine, alcune particelle infettive sono evidenziate con frecce; sono di forma regolare e più densi (più scuri) e di diametro maggiore rispetto alla maggior parte delle altre particelle, che non sono infettive. Questi ultimi possono essere pensati come esosomi, sebbene di solito non siano indicati come tali. È stato proposto che tali particelle vuote servano come esche per distogliere l'attenzione del sistema immunitario dalle effettive particelle infettive e/o dalle cellule infette.

Particelle o esosomi simili non infettivi sono stati osservati anche con molti altri virus [6] e, dati i dati riportati da Bansal et al. [1] sembra che possiamo aggiungere SARS-CoV-2 all'elenco.

2.4. Esosomi "corretti" contro vescicole apoptotiche

Un'altra distinzione da considerare è quella tra esosomi regolari, che vengono rilasciati da cellule sane o quantomeno non in procinto di morire, da vescicole rilasciate da cellule in fase di apoptosi (morte cellulare programmata). L'illustrazione a sinistra mostra gli esosomi regolari, mentre quella a destra mostra il "blebbing della membrana" in una cellula del cordone ombelicale apoptotico.

L'apoptosi è importante in molti contesti fisiologici, compreso lo sviluppo embrionale, l'eliminazione delle cellule immunitarie autoreattive, e anche nella risposta immunitaria alle infezioni virali: i linfociti T citotossici riconoscono le cellule che esprimono le proteine ​​virali e le guidano all'apoptosi bombardandole con vari agenti citotossici . Pertanto, dopo l'infezione o la vaccinazione, la proteina spike SARS-CoV-2 potrebbe concepibilmente verificarsi sia su esosomi adeguati che su vescicole apoptotiche.

Le vescicole apoptotiche sono in genere un po' più grandi degli esosomi regolari prodotti da cellule vive. Tuttavia, se osserviamo le barre della scala in queste due immagini, vediamo che alcune delle vescicole apoptotiche incipienti non sono più larghe di poche centinaia di nanometri; questo si sovrappone alla distribuzione dimensionale degli esosomi appropriati. Figura adattata da [6].

3. Spike di proteine ​​sugli esosomi dopo la vaccinazione

Passiamo ora alle prove presentate da Bansal et al. [1].

3.1. Rilevamento della proteina spike SARS-CoV-2 su un esosoma con immunogold

Questa immagine, adattata dalla Figura 1 in [1], mostra un esosoma o una vescicola che trasporta una proteina spike, come è evidente dal legame di "immunogold", cioè piccole particelle d'oro ricoperte di anticorpi. La ragione per utilizzare l'oro per rilevare molecole bersaglio specifiche nella microscopia elettronica è l'altissima densità di questo elemento; le pesanti particelle d'oro fermano il fascio di elettroni, causando punti neri come quelli mostrati in questa immagine.

Si noti che l'esosoma in questa immagine è l'unica particella del genere mostrata da Bansal et al., e inoltre che è piuttosto grande. Il confronto con la diapositiva precedente suggerisce una possibile origine apoptotica, anche se non possiamo esserne certi.

Notiamo anche che la decorazione con immunogold è piuttosto scarsa, suggerendo la presenza solo di un piccolo numero di molecole proteiche spike su questa vescicola. Tuttavia, come per il test con biglie magnetiche illustrato nella Sezione 1.4, ciò può essere dovuto all'interferenza degli anticorpi del paziente.

3.2. Andamento temporale della proteina spike sugli esosomi e degli anticorpi contro di essa

Questa figura riassume i principali risultati dello studio. La proteina del picco sugli esosomi era trascurabile il giorno della prima iniezione (D0) ed è rimasta tale il giorno 7; è aumentato il giorno 14 dopo la prima iniezione, ha raggiunto il picco il giorno 14 dopo la seconda iniezione (D14-2) ed è diminuito di nuovo ma è rimasto rilevabile a 4 mesi dopo la seconda iniezione (che è 5 mesi dopo la prima). Gli anticorpi contro la proteina spike hanno seguito un andamento temporale simile ma non sono stati ancora rilevati il ​​giorno 14 dopo la prima iniezione. Sulla base dell'apparente ritardo della risposta anticorpale rispetto alla comparsa della proteina spike associata all'esosoma, gli autori propongono che quest'ultima sia cruciale per innescare la risposta anticorpale. Possiamo fare le seguenti osservazioni:

• La scoperta più notevole e significativa dal punto di vista medico è l'espressione molto prolungata della proteina spike. Finché la proteina spike può essere rilevata sulle vescicole di membrana derivate dalle cellule, il sistema immunitario attaccherà le cellule che rilasciano queste vescicole. Ciò vale indipendentemente dal fatto che le vescicole siano esosomi "appropriati" o vescicole apoptotiche, sebbene una spiegazione semplice per l'aumento sorprendentemente tardivo della quantità di proteina spike sulle vescicole, e in particolare anche per la maggiore quantità osservata dopo la seconda iniezione, sarebbe che queste vescicole nascono attraverso l'apoptosi delle cellule che vengono attaccate e distrutte dalla risposta immunitaria.
• La risposta anticorpale molto lenta è in contrasto con la maggior parte degli altri studi, come ad esempio quello di Ogata et al. [2]. Il saggio impiegato da Bansal et al. potrebbe mancare di sensibilità. Bisogna anche tenere presente, però, che i due studi si riferiscono a vaccini simili ma non identici (vedi Sezione 1).
• Bansal et al. cercato solo la proteina spike sugli esosomi, che sono stati purificati da campioni di plasma mediante centrifugazione e filtrazione; a differenza di Ogata et al., non hanno misurato la proteina spike non legata agli esosomi in campioni di plasma intero. Questo potrebbe spiegare perché Bansal et al. non ha rilevato il picco iniziale del frammento di picco S1 osservato da Ogata et al.

3.3. Il metodo di rilevamento di Bansal per la proteina spike rimuove l'interferenza degli anticorpi

Abbiamo accennato in precedenza che Ogata et al. [2] avevano anche rilevato una comparsa ritardata dell'intera proteina spike nel plasma (Sezione 1.1), ma che le loro misurazioni erano probabilmente soggette a interferenze da parte della risposta anticorpale in aumento (Sezione 1.3). È pertinente notare che Bansal et al. [1] hanno utilizzato l'elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) invece di biglie magnetiche per analizzare le proteine ​​nei loro campioni. SDS-PAGE, che separa le specie proteiche in base al peso molecolare, romperà tutti i complessi che la proteina spike potrebbe essersi formata con gli anticorpi presenti nel plasma sanguigno. Pertanto misurerà non solo la frazione non legata ma il totale della proteina spike presente. Almeno a questo proposito, dovremmo preferire i dati riportati da Bansal et al. agli studi precedenti.

3.4. I topi possono essere immunizzati con esosomi isolati da vaccinati umani

Abbiamo notato sopra che Bansal et al. dedotto dalle loro osservazioni del decorso temporale che il picco legato all'esosoma è necessario per indurre una risposta anticorpale. Gli esperimenti raffigurati in questa figura sono stati condotti per supportare tale affermazione: ai topi sono stati iniettati esosomi isolati da persone vaccinate e hanno mostrato di sviluppare anticorpi contro le proteine ​​spike.

Sebbene la didascalia della figura nello studio originale non sia del tutto chiara, sembra che ai topi "vaccinati" sia stata somministrata la proteina spike purificata convenzionalmente, mentre ai topi "CSP" sono stati iniettati gli esosomi. Le concentrazioni anticorpali sono state misurate nei giorni 15, 21 e 30 dopo l'iniezione.

In ulteriori esperimenti, è stato anche dimostrato che i topi esprimono quantità aumentate delle citochine interferone-γ e del fattore di necrosi tumorale-α. A nostro avviso, questi risultati non costituiscono una prova molto forte a sostegno dell'ipotesi degli autori.

4. Conclusioni

• Persistenza di lunga durata della proteina spike
• Inizio ritardato dell'espressione della proteina spike, ma l'osservazione è limitata al picco sugli esosomi
• Il rapporto dell'EMA su Pfizer ha anche riportato un'insorgenza relativamente lenta dell'espressione dei picchi; d'altra parte, l'insorgenza precoce di coaguli di sangue ecc. suggerisce l'inizio precoce dell'espressione del picco

Mentre alcune affermazioni specifiche fatte da Bansal et al. può essere discusso, la persistenza molto duratura della proteina spike nel corpo è dimostrata in modo convincente. Resta da determinare se sia l'mRNA che codifica per la proteina spike che persiste o piuttosto la proteina spike stessa. Tuttavia, finché la proteina spike appare sugli esosomi o sulle vescicole apoptotiche, deve essere presente sulle membrane cellulari; e finché si trova lì, il sistema immunitario attaccherà quelle cellule.

Sono state riportate infiammazioni protratte e ridotta funzionalità degli organi sia con l'infezione virale stessa [7] che dopo la vaccinazione [8]. Mentre l'infiammazione può derivare dall'autoimmunità a valle di un intenso danno tissutale acuto, la persistenza a lungo termine della proteina spike dopo la vaccinazione offre un'altra spiegazione semplice e supporta l'idea che i vaccini daranno origine a malattie infiammatorie persistenti e lentamente in progressione.

Dobbiamo anche notare che la proteina spike persiste per almeno il doppio del tempo in cui i partecipanti ai "trial clinici" farseschi e fraudolenti di Pfizer [9,10] sono stati osservati, in media, dopo la seconda vaccinazione [11]. Ne consegue che le relazioni sugli effetti collaterali verificatesi in tali studi non possono essere complete.

Michael Palmer, medico e Sucharit Bhakdi, medico

Fonte: qui

Riferimenti

1. Bansal, S. et al. (2021) All'avanguardia: gli esosomi circolanti con la proteina Spike COVID sono indotti dalla vaccinazione BNT162b2 (Pfizer-BioNTech) prima dello sviluppo di anticorpi: un nuovo meccanismo per l'attivazione immunitaria da parte dei vaccini mRNA. J. Immunol. 207:2405-2410
2. Ogata, AF et al. (2021) Antigene del vaccino SARS-CoV-2 circolante rilevato nel plasma dei destinatari del vaccino mRNA-1273. Clin. Infettare. Dis. (prestampa)
3. Letarov, AV et al. (2021) Le particelle S1 della proteina Spike SARS-CoV-2 libere possono svolgere un ruolo nella patogenesi dell'infezione da COVID-19. Biochimica Mosca 86:257-261
4. Nielsen, SS et al. (2021) SARS-CoV-2 suscita robuste risposte immunitarie adattative indipendentemente dalla gravità della malattia. EBioMedicina 68:103410
5. Bhakdi, S. et al. (2021) Lettera ai medici: quattro nuove scoperte scientifiche sull'immunità e sui vaccini COVID-19: implicazioni per la sicurezza e l'efficacia .
6. van der Pol, E. et al. (2012) Classificazione, funzioni e rilevanza clinica delle vescicole extracellulari. Farmaco. Apocalisse 64:676-705
7. Yong, SJ (2021) Sindrome COVID lunga o post-COVID-19: fisiopatologia putativa, fattori di rischio e trattamenti. Malattie infettive 53:737-754
8. Anonimo, (2021) OpenVAERS dati sui vaccini COVID .
9. Thacker, PD (2021) Covid-19: il ricercatore denuncia i problemi di integrità dei dati nella sperimentazione sui vaccini di Pfizer. BMJ p. n2635
10. Palmer, M. et al. (2021) Prove di esperti riguardanti il ​​vaccino mRNA per bambini di Comirnaty (Pfizer) COVID-19 .
11. Anonimo, documento informativo della FDA (2020) : Pfizer-BioNTech COVID-19 Vaccine .